人乳頭瘤病毒（HPV）核酸檢測及基因分型試劑是指利用包括PCR-熒光探針法或其他分子生物學(xué)方法在內(nèi)的核酸檢測技術(shù)，以特定高危型HPV核酸（包括DNA和RNA）序列為檢測目的，對(duì)人宮頸脫落上皮細(xì)胞進(jìn)行體外定性檢測的試劑，以確定受試樣本中是否存在高于陽性判斷值水平的高危型HPV病毒，或同時(shí)鑒定感染HPV的基因型別。
人乳頭瘤病毒（HPV）核酸檢測及基因分型試劑是指利用包括PCR-熒光探針法或其他分子生物學(xué)方法在內(nèi)的核酸檢測技術(shù)，以特定高危型HPV核酸（包括DNA和RNA）序列為檢測目的，對(duì)人宮頸脫落上皮細(xì)胞進(jìn)行體外定性檢測的試劑，以確定受試樣本中是否存在高于陽性判斷值水平的高危型HPV病毒，或同時(shí)鑒定感染HPV的基因型別。此類試劑在臨床上用于：（1）篩查宮頸細(xì)胞學(xué)檢查為ASC-US（意義未確定的非典型鱗狀上皮細(xì)胞）結(jié)果的患者，以確定是否需要進(jìn)行陰道鏡檢查（以下簡稱ASC-US人群分流用途）；（2）對(duì)于30歲及以上的女性，通過檢測是否有高危型HPV感染，與宮頸細(xì)胞學(xué)檢查聯(lián)合進(jìn)行宮頸癌篩查，此檢測結(jié)合細(xì)胞學(xué)病史和其他風(fēng)險(xiǎn)因素的評(píng)估、以及臨床診療和篩查指南的要求，用于指導(dǎo)患者的管理(以下簡稱宮頸癌聯(lián)合篩查用途)；（3）對(duì)于某年齡段（根據(jù)臨床試驗(yàn)結(jié)果而定）女性，通過檢測是否有高危型HPV感染，進(jìn)行宮頸癌篩查，此檢測結(jié)合細(xì)胞學(xué)病史和其他風(fēng)險(xiǎn)因素的評(píng)估、以及臨床診療和篩查指南的要求，用于指導(dǎo)患者的管理（以下簡稱宮頸癌初篩用途）。除此以外，若申請(qǐng)人提出其他的預(yù)期用途，則應(yīng)詳細(xì)描述相關(guān)的臨床背景信息和該檢測與臨床用途的相關(guān)性，并在臨床試驗(yàn)中充分驗(yàn)證相關(guān)的臨床意義。
該類試劑應(yīng)通過臨床試驗(yàn)路徑進(jìn)行臨床評(píng)價(jià)，臨床試驗(yàn)包括產(chǎn)品臨床性能研究和針對(duì)預(yù)期用途的臨床有效性研究兩部分。臨床試驗(yàn)應(yīng)符合《體外診斷試劑注冊(cè)與備案管理辦法》《醫(yī)療器械臨床試驗(yàn)質(zhì)量管理規(guī)范》和《體外診斷試劑臨床試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》的要求，如相關(guān)法規(guī)、文件有更新，臨床試驗(yàn)應(yīng)符合更新后的要求。下面僅說明該類產(chǎn)品臨床試驗(yàn)中應(yīng)關(guān)注的重點(diǎn)問題。
1. HPV核酸臨床檢測性能研究設(shè)計(jì)
1.1臨床試驗(yàn)方法
申請(qǐng)人應(yīng)選擇已批準(zhǔn)上市、臨床普遍認(rèn)為質(zhì)量較好的同類產(chǎn)品和/或核酸序列測定方法作為對(duì)比方法，采用擬申報(bào)產(chǎn)品與之進(jìn)行比較研究試驗(yàn)，以評(píng)價(jià)擬申報(bào)產(chǎn)品檢測目標(biāo)HPV基因型的能力。需要注意的是，當(dāng)擬申報(bào)產(chǎn)品的陽性判斷值高于最低檢測限水平時(shí)，檢測結(jié)果判定為“陰性”的情況包括兩種，其一為待測樣本中存在高于最低檢測限水平的HPV靶核酸，但靶核酸水平低于陽性判斷值；其二為待測樣本中無HPV靶核酸，或靶核酸水平低于最低檢測限水平。在檢測結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析中應(yīng)分別列明各種情況，可參考表1。
1.2臨床試驗(yàn)對(duì)比方法選擇
臨床試驗(yàn)應(yīng)選擇已上市的同類產(chǎn)品作為對(duì)比試劑，評(píng)價(jià)申報(bào)產(chǎn)品與已上市同類產(chǎn)品的一致性。對(duì)比試劑的選擇應(yīng)考慮檢測的人乳頭瘤病毒型別范圍、產(chǎn)品性能等方面應(yīng)與試驗(yàn)體外診斷試劑具有良好的可比性。針對(duì)不區(qū)分型別的檢測試劑，應(yīng)采用適當(dāng)?shù)姆椒ù_認(rèn)納入臨床試驗(yàn)的陽性病例樣本HPV型別；針對(duì)分型檢測試劑，對(duì)比方法應(yīng)能夠充分評(píng)價(jià)每個(gè)型別的臨床檢測性能。選擇已上市同類產(chǎn)品進(jìn)行臨床試驗(yàn)時(shí)，對(duì)比試劑配套使用的核酸提取試劑應(yīng)滿足其說明書要求。
申請(qǐng)人亦可采用試驗(yàn)體外診斷試劑與核酸序列測定（Sanger測序）方法進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)，評(píng)價(jià)兩種檢測方法的一致性。同時(shí)還應(yīng)進(jìn)行部分病例與已上市同類產(chǎn)品進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)。以上兩方面評(píng)價(jià)結(jié)果結(jié)合起來共同論證試驗(yàn)體外診斷試劑的臨床性能。
臨床試驗(yàn)資料中應(yīng)對(duì)測序方法進(jìn)行詳細(xì)的介紹，應(yīng)采用公認(rèn)的靶基因進(jìn)行測序，針對(duì)靶基因的選擇應(yīng)提供依據(jù)。明確檢測過程中配套使用的核酸提取試劑，針對(duì)測序方法提交性能驗(yàn)證數(shù)據(jù)，證明測序方法與試驗(yàn)體外診斷試劑的可比性。如測序試驗(yàn)委托其他機(jī)構(gòu)完成，還應(yīng)提交由臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)委托第三方機(jī)構(gòu)/實(shí)驗(yàn)室開展相關(guān)試驗(yàn)的測序服務(wù)合同/協(xié)議，提交相關(guān)機(jī)構(gòu)資質(zhì)和選擇依據(jù)。
有關(guān)核酸序列測定方法的資料要求：臨床試驗(yàn)中如涉及核酸序列測定方法，則建議對(duì)擴(kuò)增子進(jìn)行雙向測序。應(yīng)在臨床研究報(bào)告中對(duì)選用的測序方法做詳細(xì)介紹，并提供以下關(guān)于測序試驗(yàn)的詳細(xì)信息及資料。
1)測序方法原理、測序儀型號(hào)、測序試劑及消耗品的相關(guān)信息。
2)測序方法所用引物相關(guān)信息，如基因區(qū)段選擇，分子量、純度、功能性試驗(yàn)等資料。
3)對(duì)所選測序方法的分析性能進(jìn)行合理驗(yàn)證，尤其是最低檢測限的確認(rèn)，建議將所選測序方法與擬申報(bào)產(chǎn)品的相關(guān)性能進(jìn)行適當(dāng)比對(duì)分析。
4)測序方法應(yīng)建立合理的陽性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品對(duì)臨床樣本的檢測結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量控制。
5)提交有代表性的樣本測序圖譜及結(jié)果分析資料。
1.3臨床試驗(yàn)受試人群的選擇及樣本采集
病例選擇及樣本類型：受試者應(yīng)包含各種臨床表現(xiàn)的人群，如：宮頸細(xì)胞學(xué)檢查正常者、宮頸上皮細(xì)胞異常者以及診斷為宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）和宮頸浸潤癌等的患者，受試者年齡應(yīng)在<30、30～39、40歲以上年齡段均有分布。
臨床試驗(yàn)如選擇與已上市同類產(chǎn)品進(jìn)行比對(duì)的設(shè)計(jì)，且試驗(yàn)體外診斷試劑與對(duì)比試劑由于樣本采集、處理、保存等差異不能使用同一份樣本進(jìn)行檢測，此時(shí)可針對(duì)每位受試者進(jìn)行兩次樣本采集，并分別進(jìn)行試驗(yàn)體外診斷試劑和對(duì)比試劑的檢測，兩次采集樣本的順序應(yīng)遵循隨機(jī)原則。需要注意的是，臨床試驗(yàn)應(yīng)保證一次樣本采集不會(huì)影響下一次樣本采集。
1.4臨床試驗(yàn)樣本量
建議以與對(duì)比方法的比較研究為基礎(chǔ)進(jìn)行樣本量估算。臨床試驗(yàn)陽性樣本和陰性樣本數(shù)量應(yīng)分別滿足統(tǒng)計(jì)學(xué)要求。針對(duì)與Sanger測序法或同類已上市產(chǎn)品的對(duì)比試驗(yàn)，可采用目標(biāo)值法公式分別估算整體最低陽性和陰性樣本例數(shù)。
樣本量估算公式如下：
其中陽性符合率和陰性符合率的臨床可接受標(biāo)準(zhǔn)（P0）建議不低于90%。臨床試驗(yàn)結(jié)果中，相關(guān)評(píng)價(jià)指標(biāo)的95%置信區(qū)間下限應(yīng)不低于預(yù)設(shè)的臨床可接受標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)評(píng)價(jià)指標(biāo)P接近100%時(shí)，上述樣本量估算方法可能不適用，應(yīng)考慮選擇更加適宜的方法進(jìn)行樣本量估算和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，如精確概率法等。申請(qǐng)人亦可以選擇其他樣本量估算模型，但應(yīng)詳述該樣本估算模型及相關(guān)參數(shù)設(shè)置的的科學(xué)性、合理性。
臨床試驗(yàn)中，針對(duì)產(chǎn)品檢測范圍內(nèi)的每種HPV基因型均應(yīng)具有一定的陽性例數(shù)。結(jié)合產(chǎn)品臨床性能評(píng)價(jià)需要及HPV感染陽性率，建議16型陽性不低于100例，18型陽性不低于50例，其他各型別，如能夠分型，建議各型別分別不低于30例；如不能分型，產(chǎn)品能夠涵蓋的各亞型建議分別不低于20例。針對(duì)臨床試驗(yàn)過程中確實(shí)難以收集的亞型，在提供相關(guān)證據(jù)的前提下，病例數(shù)可酌情減少。
鑒于此類產(chǎn)品樣本采集過程對(duì)檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性至關(guān)重要，因此，如產(chǎn)品可采用不止一種樣本保存液，則應(yīng)針對(duì)不同的樣本保存液進(jìn)行同源樣本的比較研究試驗(yàn)，證明不同的樣本保存液不會(huì)影響檢測結(jié)果。相關(guān)比較研究試驗(yàn)應(yīng)于2家以上（含兩家）臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)進(jìn)行，樣本例數(shù)不少于100例。
1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
應(yīng)選擇合適的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)比較研究試驗(yàn)的檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行合理分析。對(duì)于此類試劑的比較研究試驗(yàn)，常選擇交叉四格表的形式總結(jié)兩種方法定性檢測結(jié)果，計(jì)算陽性符合率、陰性符合率和總符合率，并計(jì)算95%置信區(qū)間，以考察兩種方法檢測結(jié)果的一致性。
對(duì)于基因分型試劑，臨床試驗(yàn)中應(yīng)分別驗(yàn)證該產(chǎn)品對(duì)可鑒別HPV基因型的臨床檢測準(zhǔn)確性，針對(duì)不同基因型HPV分別完成如上所述的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
結(jié)果差異樣本的分析和驗(yàn)證：對(duì)于兩種方法的檢測結(jié)果不一致的樣本，申請(qǐng)人應(yīng)針對(duì)具體情況進(jìn)行合理分析，必要時(shí)選擇其他合理的方法進(jìn)行驗(yàn)證，亦可結(jié)合患者的臨床病情進(jìn)行分析。
2.預(yù)期用途的臨床有效性研究設(shè)計(jì)
2.1針對(duì)ASC-US人群分流用途
2.1.1臨床試驗(yàn)方法
申請(qǐng)人應(yīng)在適合進(jìn)行宮頸細(xì)胞學(xué)檢查的女性中，入組宮頸細(xì)胞學(xué)檢查為ASC-US的受試者，針對(duì)入組的ASC-US人群首先采用擬申報(bào)產(chǎn)品進(jìn)行HPV核酸檢測，然后，無論HPV檢測結(jié)果如何，均應(yīng)進(jìn)行陰道鏡檢查，根據(jù)陰道鏡檢查結(jié)果，必要時(shí)取樣進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。建議采用同一份宮頸上皮細(xì)胞樣本進(jìn)行細(xì)胞學(xué)檢查和HPV檢測，以避免樣本取材不同帶來的偏差；而宮頸細(xì)胞樣本采集與陰道鏡檢查之間的時(shí)間間隔不應(yīng)過長，建議不超過12周。以陰道鏡檢查和組織病理學(xué)檢查結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)價(jià)擬申報(bào)產(chǎn)品的臨床性能。
2.1.2臨床試驗(yàn)受試人群
臨床試驗(yàn)入組人群應(yīng)為宮頸細(xì)胞學(xué)檢查為ASC-US的受試者，臨床試驗(yàn)建議前瞻性入組，應(yīng)避免選取已確定需進(jìn)行陰道鏡檢查的人群，以免造成入組人群的傾向性，臨床試驗(yàn)應(yīng)以來自篩查的人群為主。入組人群應(yīng)盡量在不同的年齡范圍均有分布（<30、30～39和40歲以上），各年齡組受試者例數(shù)及CIN2以上病例均應(yīng)有一定的病例數(shù)。
2.1.3臨床試驗(yàn)病例數(shù)
應(yīng)根據(jù)檢測試劑靈敏度要求、疾病發(fā)病率等對(duì)入組樣本例數(shù)進(jìn)行科學(xué)的分析和計(jì)算，本臨床研究建議以臨床靈敏度為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用抽樣精度的模型進(jìn)行樣本量估算。臨床試驗(yàn)終點(diǎn)為病理學(xué)檢查結(jié)果≥CIN2。可采用如下公式：
2.1.4 統(tǒng)計(jì)分析
臨床試驗(yàn)結(jié)果一般以四格表的形式進(jìn)行總結(jié)，并據(jù)此計(jì)算臨床靈敏度、臨床特異性、陽性預(yù)期值、陰性預(yù)期值、陽性似然比、陰性似然比，并采用適當(dāng)?shù)姆椒ㄓ?jì)算95%置信區(qū)間；對(duì)于基因分型試劑，還需針對(duì)可鑒別的基因型單獨(dú)完成上述數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，應(yīng)能夠支持基因分型的臨床意義；數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析方法參見表2和表3。
臨床試驗(yàn)結(jié)果：應(yīng)通過分析靈敏度、特異度、陽性似然比和陰性似然比的結(jié)果判斷擬申報(bào)產(chǎn)品用于ASC-US人群分流的臨床性能是否能夠滿足臨床要求。
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